尊龙凯时 专注于提供细胞体外基因敲除的解决方案，致力于为客户量身定制细胞基因敲除的服务。至今，我们已经推出了多种细分的敲除服务，欢迎与尊龙凯时团队联系，获取技术路线及成功案例的详细资料。

尊龙凯时 提供针对真核细胞的体外基因敲除定制服务。针对这一服务，尊龙凯时 团队将定期更新常见问题解答（Q&A），以更好地服务我们的客户。以下是我们的Q&A【2503版】中的前20个问题，关于基因敲除定制服务的相关内容，请详细阅读。

服务指南 | 尊龙凯时 高通量基因敲除定制服务（RNP法）Q&A【2409版】

21. 如何验证基因敲除是否成功？

22. 精准敲除与模糊敲除有何区别？(1) 精准敲除：通过同源重组（HDR，Homology-Directed Repair）机制，在目标基因中引入精确修饰（如特定片段删除、点突变或插入），从而完全或部分失活基因功能。精准敲除采用的实验策略往往不同于一般的基因敲除，通常所说的基因敲除是指模糊敲除。尊龙凯时 提供精准敲除定制服务，针对靶基因指定区域进行核苷酸序列的精准敲除、敲入及突变等服务。

(2) 模糊敲除：通过非同源末端连接（NHEJ，Non-Homologous End Joining）机制，在目标基因的指定区域随机引入插入或缺失（Indel）突变，从而破坏基因功能。

23. CRISPR/Cas9方法可以敲除的最大片段范围是多少？理论上可以敲除从1kb到1Mb的片段，通过多靶点切割技术或与其他技术（如CRISPRa/i、表观遗传修饰）结合，可以实现超大片段的敲除（1Mb）。

24. 如何提高原代细胞的编辑效率？可以使用病毒载体如慢病毒/AAV整合至基因组，电场诱导细胞膜穿孔贴壁或悬浮原代细胞（需优化参数），核转染直接将Cas9-RNP导入难以转染的细胞（如原代T细胞），或使用脂质纳米颗粒阳离子脂质包裹Cas9-sgRNA复合物，适用于原代肝细胞和成纤维细胞。

25. 如何提高基因敲除效率？26. 如何分析基因敲除后的表型变化？27. 如何区分纯合敲除与杂合敲除？28. CRISPR RNP法适用于哪些细胞及场景？

结语

CRISPR/Cas9 RNP基因编辑法是将靶基因相应的多条体外合成的single-guide RNA（sgRNA）与Cas9蛋白体外混合形成核糖核蛋白复合物（Ribonucleoprotein，简称RNP），通过电转化或脂质体转染的方式将RNP递送到细胞内部。这一方法可以高效、稳定地构建遗传细胞池（即稳转细胞多克隆），节省了传统的慢病毒/质粒方法带来的体内转录翻译和抗性筛选的过程。

由于RNP在细胞内进行基因组编辑后会在72小时内迅速降解，并且不引入外源序列，尽量保持了细胞的表型，是目前脱靶效应最低的方式。这有效避免了病毒基因组的随机整合，降低了对后续功能性实验的影响，也减少了传统方法中Cas9和sgRNA持续表达可能造成的基因组不稳定及高脱靶风险。基于尊龙凯时的CRISPR/Cas9 RNP法，基因敲除细胞系的构建正在快速发展，将全面取代传统方法。